Anna sinh ra ở thành phố Valladolid thuộc Vương quốc Tây Ban Nha, là con gái lớn nhất của Hoàng đế Maximilian II của Đế quốc La Mã Thần thánh và María của Áo, Hoàng hậu của Thánh chế La Mã. Hai vợ chồng là chị em họ, vì María là con gái của Hoàng đế Karl V của Thánh chế La Mã - anh trai của Ferdinand I của đế quốc La Mã Thần thánh — cũng là ông nội của Anna. Khi Anna được sinh ra, Thánh chế La Mã vẫn đang được cai trị bởi ông ngoại là Hoàng đế Karl V, lúc này ông nội bà vẫn chưa được truyền ngôi.

Năm lên 4 tuổi, Ana đến Viên. Trong các người con, bà là người được cha mình yêu thương nhất. Theo những câu chuyện ghi lại, Hoàng đế Maximilian II thích chơi cá cược với con gái mình. Vào một hôm, Anna ngã bệnh, và Hoàng đế Maximilian II đã không tiếp các công sứ từ Hungary vì mãi lo lắng cho con gái. Từ lúc nhỏ đến trưởng thành, Anna tiếp thu nền giáo dục Công giáo, dù cha bà là Hoàng đế Maximilian lại có thiên hướng ủng hộ Tin Lành.

Với tư cách là người con lớn nhất của Hoàng đế Maximilian, Anna được bàn định đính hôn với người anh họ là Carlos, Thân vương xứ Asturias, con trai của Quốc vương Tây Ban Nha là Philip II, với việc này thì nhánh Habsburg của Thánh chế La Mã và nhánh ở Tây Ban Nha sẽ được giữ vững liên kết. Tuy nhiên Carlos qua đời ngay vào năm 1568, khiến liên kết này đứt quãng. Sau đó, vợ thứ 3 của Philip II là Elisabeth qua đời, khiến cho vấn đề liên hôn giữa hai nhánh Habsburg được triển khai. Cuộc định ước này bị phản đối rất nhiều bởi các thế lực, trong đó có Giáo hoàng Piô V, nhưng sau cùng vẫn được giải quyết[1].

Năm 1569, hôn nhân giữa Ana với chú mình được tuyên bố khắp Châu Âu, và vào tháng 5 năm 1570 thì cả hai được kết hôn thông qua trung gian. Mùa thu năm ấy, Ana di chuyển từ Áo đến Tây Ban Nha, đồng hành là hai người em trai, Albert và Wenceslaus. Vương hậu Ana sinh 3 lần liên tiếp đều là con trai, tuy nhiên của chỉ có người con út là sống được đến trưởng thành, chính là Quốc vương Felipe III của Tây Ban Nha.